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目的 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建抗肌萎縮蛋白 (dystrophin，Dmd) 基因第23號(hào)外顯子點(diǎn)突變 的Dmd基因突變小鼠，分析并驗(yàn)證該小鼠在肌肉及免疫系統(tǒng)中的表型變化，為杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等疾病提供評(píng)價(jià) 模型。>>>商務(wù)洽談，點(diǎn)此處，在線咨詢

方法 針對(duì)Dmd基因23號(hào)外顯子序列特征，設(shè)計(jì)合成小向?qū)NA (small guide RNA，sgRNA);將Cas9 mRNA、sgRNA片段和oligo donor DNA顯微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，并將該受精卵移植至代孕鼠后出生 獲得 F0 代小鼠;F0 代小鼠通過交配獲得子代小鼠后，基因型鑒定篩選得到 Dmd 基因陽性突變小鼠 (命名為 DmdMu/+小鼠)。選擇 3 月齡和 9 月齡的雄性半合子 DmdMu/+小鼠 (命名為 DmdMu/Y小鼠) 和野生型 C57BL/6J 小鼠 (作為對(duì)照) 用于表型驗(yàn)證：稱量記錄活體小鼠體重，并通過懸掛實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠肌張力;采集心臟和半腱肌，采用 HE染色法觀察組織病理學(xué)變化，進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)9月齡小鼠肌肉組織內(nèi)Dmd蛋白的表達(dá)情況。利用 脂多糖誘導(dǎo)建立DmdMu/Y小鼠急性炎癥模型，采集小鼠頜下靜脈血，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中性粒細(xì)胞和單核 細(xì)胞比例變化。

結(jié)果 基因組測(cè)序和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明 Dmd 基因點(diǎn)突變小鼠 (即 DmdMu/+小鼠) 構(gòu)建成功， DmdMu/+小鼠骨骼肌和心肌中未見Dmd蛋白表達(dá)，與野生型C57BL/6J小鼠相比明顯下降 (P<0.05)。與背景相同的 野生型小鼠相比較，3月齡和9月齡的雄性半合子突變小鼠 (DmdMu/Y小鼠) 體重明顯減輕 (P<0.01)，肌張力顯著 下降 (P<0.05);9月齡DmdMu/Y小鼠的骨骼肌和心肌發(fā)生肌間隙變寬等明顯病變。未注射脂多糖時(shí)，與野生型小鼠 相比，3 月齡 DmdMu/Y小鼠的外周血中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例顯著降低 (P<0.01);經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后，3 月齡 DmdMu/Y小鼠的外周血中性粒細(xì)胞比例仍然較野生型小鼠顯著降低 (P<0.01)，而9月齡DmdMu/Y小鼠的外周血中性 粒細(xì)胞比例在脂多糖誘導(dǎo)后顯著升高 (P<0.05)，但較野生型小鼠仍顯著降低 (P<0.01);同月齡DmdMu/Y小鼠經(jīng)脂 多糖誘導(dǎo)后外周血單核細(xì)胞比例與野生型小鼠相比僅有偏低趨勢(shì) (P>0.05)。

結(jié)論 成功構(gòu)建了Dmd基因突變小鼠 模型，證實(shí)該基因具有維系肌肉組織正常形態(tài)和肌張力等重要功能，并初步發(fā)現(xiàn)該基因缺失會(huì)減少外周血液中性粒 細(xì)胞比例，為后續(xù)研究杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者的免疫系統(tǒng)異變機(jī)制提供新的思路。

閱讀原文：Dmd基因突變小鼠構(gòu)建及在肌肉及免疫系統(tǒng)的表型驗(yàn)證.pdf

來源：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)2024年第1期

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